yjf1026 (2014-8-27 10:24:59)
我觉得你应该继续往下做的你的实验，而不是纠结这个。
ladyhuahua (2014-8-27 10:25:17)
楼上正解。T载体确实会产生很多假阳性，纠结于此于事无补。
bhka (2014-8-27 10:25:50)
不知你用的是哪个公司的T载体。大约2005年左右的时候用TAKARA的T载体，连接效率很高，基本上做转化我只挑3个斑就3个全中。后来到了2010年左右的时候TAKARA的T载体连接效率就很低了，差不多低到10个只能中1个。让我很失望。
summerxx (2014-8-27 10:26:07)
长片段酶连效率会低于短片的，适当延长酶连时间。
leifengta (2014-8-27 10:27:00)
4℃连接过夜，想效果更好再16℃连2-4h。
orangecake (2014-8-27 10:27:20)
我用16度连接过夜，也还行
yhz1973 (2014-8-27 10:27:51)
QUOTE:
原帖由 yjf1026 于 2014-8-27 10:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
我觉得你应该继续往下做的你的实验，而不是纠结这个。
我当然是没有耽误后续的实验了，只是出现问题总要分析一下原因吧
yhz1973 (2014-8-27 10:28:16)
QUOTE:
原帖由 bhka 于 2014-8-27 10:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
不知你用的是哪个公司的T载体。大约2005年左右的时候用TAKARA的T载体，连接效率很高，基本上做转化我只挑3个斑就3个全中。后来到了2010年左右的时候TAKARA的T载体连接效率就很低了，差不多低到10个只能中1个。让我很失望。 ... 我用的是Promega的pGEM-T easy vector，小片段挺好的，大片段就很不好用了
yhz1973 (2014-8-27 10:28:33)
QUOTE:
原帖由 summerxx 于 2014-8-27 10:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
长片段酶连效率会低于短片的，适当延长酶连时间。 我连的时间挺长了，都快一整天了
redbutterfly (2014-8-27 10:28:57)
应该恭喜你，我载体一直构建不出来。
redbutterfly (2014-8-27 10:29:13)
我的不是T载体构建，就是常规的酶切，连接，一直没成功。目前还没找到原因。
yhz1973 (2014-8-27 10:29:37)
QUOTE:
原帖由 redbutterfly 于 2014-8-27 10:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
我的不是T载体构建，就是常规的酶切，连接，一直没成功。目前还没找到原因。
你是用什么酶做的连接
baidukk (2014-8-27 10:29:57)
T载体本来也就不到5K的大小吧，连4K的片段进去很难的，所以效率低是很正常的，这不算是什么问题吧~
dragonkilly (2014-8-27 10:30:50)
QUOTE:
原帖由 yhz1973 于 2014-8-27 10:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
你是用什么酶做的连接 确实是这样，我这几天连的2k多的片段就挺好的，4k多的就不行了，不知道有什么适合长片段的载体
dragonkilly (2014-8-27 10:31:45)
NEB T4连接酶。今天测序结果刚回来，貌似不理想，还再DNAman中。。。
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我用的也是这个酶，如果你的测序结果不理想的话应该是PCR的原因吧，可以试试高保真酶